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生牛乳中金黄色葡萄球菌的分离鉴定与药物敏感性分析

放大字体  缩小字体 发布日期:2016-05-30  浏览次数:0
  摘要:采用金黄色葡萄球菌测试片快速筛选的方法,对采集于陕西省西安市和渭南市20份样品中S.aureus进行分离鉴定及药物敏感性研究,以了解此地区生牛乳中S.aureus的污染情况及对药物敏感性。结果表明:S.aureus测试片可用于大量生牛乳样品中S.aureus的初筛工作,方便且省力;S.aureus的检出率为10%;检出的两株S.aureus对青霉素都为耐药,其中一株对磺胺异恶唑也表现为耐药,两株S.aureus对复方新诺明、红霉素、万古霉素、氧氟沙星、克林霉素都表现为敏感。牛场应根据药物敏感性实时调整抗感染药物的使用方案。
  关键词:金黄色葡萄球菌;分离鉴定;药物敏感性;生牛乳
  中图分类号:S879.1
  文献标识号:A
  文章编号:1001-4942(2015)10-0092-03
  金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性病原菌,是引起反刍动物乳房疾病最普遍的致病菌,主要表现为奶牛和羊的临床和亚临床乳房炎。据报道,在奶牛场中,临床型乳房炎的发病率为2%~8%,隐性乳房炎的发病率更高,这种牛生产的生鲜乳是易被S.aureus污染的食品原料,并且S.aureus能产生高温灭菌不能破坏的肠毒素,将会严重影响消费者的身体健康。因此,对生牛乳中S.aureus的研究尤其是检测非常重要。随着抗生素的广泛使用,S.aureus对目前使用的各种抗生素可能产生一定程度的耐药,给奶牛乳房炎的治疗带来一定困难,所以及时掌握S.aureus的耐药性情况是防治该病的关键。
  本试验以生牛乳为原料,以S.aureus为研究对象,采用S.aureus测试片进行快速筛选的方法,研究生牛乳中S.aureus的分离鉴定及药物敏感性,旨在为生牛乳中S.aureus的分离鉴定及药物敏感性分析提供一种方便、省力的检测方法,为及时防止由S.aureus引起的食源性疾病提供可靠的技术支持,也为原料奶的安全生产提供科学依据。
  1材料与方法
  1.1材料
  生牛乳:采自陕西省西安市和渭南市,共20份样品。将采集的生牛乳放入冰盒中保存,并在12h内分离样品;S.aureus测试片:购自北京良润生物科技有限公司;S.aureus标准菌株[CMCC(B)26003]:购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心;药敏测试盒:购白天津金章科技发展有限公司;API staph试剂盒、葡萄球菌试剂盒,购自法国生物梅里埃公司。
  主要培养基:7.5%氯化钠肉汤、S.aureus显色培养基、哥伦比亚血平板培养基,均购自广东环凯微生物科技有限公司。
  主要仪器:APILAB Plus系统(法国生物梅里埃);生化培养箱(购自上海新苗医疗器械制造有限公司)。
  1.2方法
  1.2.1生牛乳在S.aureus测试片上初步筛选无菌操作取25mL生牛乳于225mL灭菌生理盐水中,混匀;取1mL均匀放于S.aureus测试片中进行初筛,37℃培养24h,有蓝色菌落生长为可疑阳性,没有蓝色菌落生长为阴性。同时设空白对照。
  1.2.2菌株的分离纯化及鉴定 取下有S.aureus可疑阳性菌落的测试片,置于无菌7.5%氯化钠肉汤中,37℃培养24h。取一菌环肉汤划线于金黄色葡萄球菌显色培养基中,37℃培养24h,紫红色为可疑菌落。挑取紫红色可疑菌落,划线于哥伦比亚血平板培养基,37℃培养24h。从哥伦比亚血平板上取菌落做成0.5个麦氏浓度的均匀菌悬液,填充API试剂条中,37℃培养24h,加入APILAB Plus系统判读。
  1.2.3药敏试验 采用微量肉汤稀释法,试验方法及结果判定按美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2015年标准进行。
  2结果与分析
  2.1生牛乳在S.aureus测试片上初步筛选结果
  陕西省西安市和渭南市20份生牛乳在S.aureus测试片上培养24h后发现,有3份样品测试片出现蓝色斑点,判断为S.aureus阳性疑似菌落,菌落颜色明显,界线清晰,与空白对照和阴性测试片差异明显,筛查结果明显且直观,如图1所示。
  2.2菌株分离及生理生化鉴定
  将3份有可疑菌落的测试片进一步培养、分离、纯化,最终通过APILAB Plus判定为:S.aureus 2株,鉴定结果分别为:SX1%ID=97.8%,T=1.00;SX2%ID=98.1%,T=0.9;木糖葡萄球菌(S.xylosus)1株;S.aureus的检出率为10%。结果表明,取下阳性快检测试片后,采用与国标相同的培养基进行培养、分离、纯化,结果可以很好地满足生化鉴定的需要。
  2.3药敏试验结果
  采用目前国际通用的美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2015年标准规定的微量肉汤稀释法和结果判定方法,对分离得到的2株S.aureus进行药敏试验,结果见表1。表明,在7种抗生素中,两株S.aureus对青霉素及SX2对磺胺异恶唑表现为耐药,其他则表现为敏感。
  3讨论与结论
  生牛乳中S.aureus的筛选分离通常按照GB4789.10-2010的方法,先将所有样品富集培养,再在选择性培养基上进行分离鉴定,工作量大,消耗人力、物力多。何源等对重庆市生牛乳中S.aureus的污染状况调查、薛秀恒等对安徽生牛乳中S.aureus的污染状况调查均采用以上方法。本试验用S.aureus测试片进行初筛,培养的样品由20个减少到3个,减少了后续培养的数量;操作方法只是将1mL稀释10倍的样品加到测试片上培养即可,操作非常简便。该测试片对S.aureus的识别率为100%,对非葡萄球菌属的抗干扰能力良好。对葡萄球菌属的检测发现,测试片对木糖葡萄球菌的抑制率约为80%。所以测试片上显色的菌落仍需后续鉴定(以上数据由北京良润生物科技有限公司提供)。在本试验中经过测试片初筛后得到的3个可疑菌株最后有一株鉴定为木糖葡萄球菌,与北京良润生物科技有限公司提供的数据吻合。说明本测试片不会出现假阴性,但可能会有假阳性出现。因此,本测试片可用于大量生牛乳样品的S.aureus的初筛工作,以减少工作量。
  世界范围内,该菌在生牛乳中的检出率有国家和地区的差异,检出率在12%~79%不等,本试验中生牛乳中S.aureus的检出率为10%,这与重庆市(24.67%)、安徽省(16.7%)的研究结果差异较大,说明不同地区生牛乳中S.aureus污染状况不同。林柏玲等研究发现,上海和天津两个城市牛乳中S.aureus污染情况相差较大(上海为0,天津为26.09%),可能由于上海属于比较现代化的大都市,企业的生产管理制度均比较严格,牧场的生产条件和周边环境的要求较天津市高。这也说明只要对生产过程中每个环节进行严格监控,生牛乳的质量是可以得到保证的。
  本试验中两株S.aureus对青霉素都为耐药,对复方新诺明、红霉素、万古霉素、氧氟沙星、克林霉素都为敏感,可能因为在奶牛场的养殖过程中青霉素长期单一使用。分离于不同奶牛场的S.aureus对所选7种抗生素的耐药性也不同,这与赵修龙等的研究结果一致,这主要与不同牛场的管理和预防性用药有关。本试验中复方新诺明、红霉素、万古霉素、氧氟沙星、克林霉素对两株菌都有良好的抗菌作用,建议用于此地区奶牛隐性乳房炎的防治。建议奶牛场建立细菌药敏动态数据库,根据药物敏感性,实时调整抗感染药物的使用方案,有针对性地选用药物,经常更换抗生素种类。
 
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